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提 RNA 的实战技巧 快储藏!

  群所周知,RNA 提是壹项困苦的工干。微少见的应敌带拥有 RNA 投降松、低产比值和 / 或纯度以及 DNA 垢染。余外面,不一的战利品典型拥有己己己壹道的特点,需寻求特佩剩意。比如,微生物 (如革兰氏阳性 / 阴性细菌、真菌、古生菌等) 的细胞壁装置靖,不善被募化学和酶松。其他范本典型,如粪便和栽物含拥有按捺剂 (如多酚类、腐殖酸 / 黄腐酸、单宁酸等),却与 RNA 共沉淀,并却按捺下流剖析,如 RT-qPCR。

  下面,迷信家分享了他们的 RNA 佩退技巧,特佩是最父亲限度局限地回收高品质、无 DNA 的 RNA 的即兴实阅历。

  收集儿子战利品后摆荡 RNA

  RNA 是不摆荡的,极善投降松。好多战利品含拥有高程度的 RNase,会快快投降松 RNA。为了使之最小募化,最好在收集儿子时摆荡范本中的 RNA。日用的战利品摆荡方法带拥有液氮快快冷冻结、干冰凌乙醇浴或-80°C 冷冻结室。条是,此雕刻些方法也拥有缺隐,如核酸的冻结融损伤,并不是所拥局部切磋人员在收集儿子战利品时邑能即雕刻便用此雕刻些方法。

  最佳 RNA 摆荡方法:

  1. 在裂松缓冲液中即雕刻溶松,使 RNase 违反活 (如 TRIzol?、RNA 裂松缓冲液等)。然后战利品却以即雕刻处理或冷冻结管。

  2. 浸泡在摆荡试剂中 (如 DNA/RNA Shield),使核酸酶违反活,并在环境温度下长时间维养护核酸。此雕刻对正实地收集儿子范本或处理宝贵的病人范本 (比如布匹局活检、全血等) 的切磋人员特佩拥有僚佐。

  确保战利品完整顿溶松:

  在 RNA 提经过中,最父亲限度局限地提高 RNA 产量和品质的最佳方法是保障战利品的完整顿裂松。条是,并不是所拥局部范本邑对相反的裂松方案敏感。比如,血细胞 (如淋巴细胞、PBMCs 等) 和微生物细胞日日更难以拥有效地溶松。偏偏添加以基于涤除剂的裂松缓冲液能并不尽是趾够的。为了提高裂松效实,却以将裂松缓冲液与机械裂松步儿子 (研磨珠破开零碎) 婚配,容许在裂松液下流参加以酶裂松步儿子 (如蛋清酶 K、溶菌酶等)(图 1)。

  ?图 1:从裂松缓冲液中提父亲肠杆菌细胞的尽 RNA,用捣零碎珠 (范本 1-3) 机械匀浆,而不是但用裂松缓冲液提 (范本 4-6)。在裂松缓冲液中终止机械均质募化却产生摆荡的 28S/16S 核糖体带和更高的核糖体完整顿性 (RIN)。Agilent2200 TapeStation?。

  余外面,犯得着剩意的是,完整顿的战利品裂松也拥有助于提经过的顺顺手终止。柱状萃取法不完整顿裂松却招致柱堵塞塞、缓冲液结转、DNA 垢染和不完整顿洗脱。考虑到此雕刻所拥有,Zymo 切磋曾经养稀蓄锐为所拥有微少见的范本典型优募化最拥有效的裂松方案。